首創於2005年的次世代定序(Next-Generation Sequencing,簡稱NGS),可以快速多量的提供基因相關的資訊,對於生物科技研發和醫療診斷的檢測,具有劃時代的意義。基因體研究中心副研究員邱國平老師,近期於Scientific Reports 期刊發表其團隊所研發的TOP-PCR技術,這個方法可以顯著提高目前NGS的靈敏度,並打破「量」的限制,針對血液中微乎其微,夾帶腫瘤或其它疾病訊息的基因片段做更靈敏有效的檢測。

DNA內蘊藏著我們的基因密碼,基因體學的研究進一步顯示,DNA解碼不只是我們從科學辨識影集裡所看到的追蹤辦案的法寶,更是改進目前醫療技術的希望。科學家在DNA解碼的過程中,需要經過一定的程序,這些步驟包括樣本製備、定序與解讀。基因定序後,科學家根據這些訊息,可以解出物種遠古以來的遺傳史,也可以分辨出細胞發生突變的相對位置與受影響的基因。

事實上,只要是一試管的血液、一滴口水、甚至是尿液,除了細胞之外,基因科學專家還可以找出一些游離的DNA片段。這些DNA片段不僅來自我們體內的正常細胞,還可能來自侵入體內的細菌、黴菌或病毒,也可能來自我們體內的腫瘤細胞或懷孕母體內胎兒的遺傳物質!這類的DNA,科學家稱之為「細胞外的DNA」,常以英文cell-free DNA或其縮寫cfDNA做為簡稱。當細胞老化、凋零破裂後,有許多原來存在於細胞內的DNA片段,就隨著體液飄流,成為cfDNA,最近被認定是一種最為安全方便取得的檢體。

腫瘤的cfDNA 會不會飄流到身體的某一器官後產生後續影響?如果可以在血液中檢測出腫瘤的cfDNA,是不是可以發展出一套簡單的驗血方法,代替目前必須做的穿刺檢查?這些都是有意義的研究題目。但是,有一個前題,就是要能夠有足量的cfDNA!

可惜的是,以目前最先進的儀器來說,不到0.5毫微克(10-9 g, 或nanogram)的量,就無法製備定序樣本(圖2,A),所以也就無法得到答案了。

在執行與陳鈴津院士針對早發性乳癌(Early-Onset Breast Cancer,簡稱EOBC)的合作計劃時,邱國平的研究團隊修改之前他們在參與登峰計劃時所開發出的生物科技,進而發展出一種新型的PCR方法,叫做「T寡核苷酸引發的聚合酶連鎖反應 」(T Oligo-Primed Polymerase Chain Reaction),簡稱為TOP-PCR (圖1)。這個方法使用P oligo 及 T oligo 所組成的半接合體 (half adaptor,簡稱HA) 框住cfDNA的兩端,然後以T oligo 作為PCR 的唯一primer (引子)。

 2017TOP PCR F1
圖1. TOP-PCR複製DNA的原理.半接合體(Half adaptor)以紅框標示。


PCR 是英文Polymerase Chain Reaction (聚合酶連鎖反應)的縮寫,也是基因定序之前必須執行的步驟,用以做出夠量的複製品,才可以接著做準確的分析。否則微弱的訊號就無法被偵測到。PCR的方法有很多種,方法的好壞與實驗設計的優劣會深深影響DNA複製的效率。對cfDNA而言,在做定序之前,研究人員必須先把DNA的片段分離出來。然後在分離出來的各種DNA片段的兩端都必須接上adaptor (接合體),也就是要把這些DNA片段兩端先框住,這個加在兩邊的框,是特別設計的接合體。然後也把做為primer的寡核苷酸一起放入PCR機器。一般的PCR使用兩個primer,TOP-PCR只用一個。接合體的序列與primer的序列有對應關係,用以定義複製的起點,經過聚合酶在重覆的連鎖反應之後,可製造出上萬倍的複製品,就好像影印機一樣。

這個adaptor 與primer 的設計,對於複製的效率扮演著重要的角色,目前定序界所使用的PCR 方法無法處理極少量的DNA,因為經過聚合酶的連鎖反應之後其所使用的adaptor本身反而自連成雙倍體或多倍體,使得PCR無法正常進行(圖2,A)。而邱國平的研究團隊所研發出來的半接合體,就排除了這個問題(圖2,B)。

同時值得注意的是,在複製之前,一般的實驗步驟之間經常須要純化DNA,以便去除雜質增進下一步反應,但是純化DNA就多多少少會造成流失。另外,adaptor如果接合不完全 (例如只接單邊或完全沒有接上) 的話,PCR就無法有效地複製。低倍份(low copy number) 的遺傳物質一旦流失或沒有經過有效複製的話,就會失去它的相關資訊。為了防止流失,邱老師的團隊已經完成單一試管(single-tube)的實驗步驟,無須純化DNA直到複製完成。半接合體的接合效率也由一般的低於40%,提高到將近70%。這個實驗步驟與TOP-PCR的組合,是目前世界上複製體液內蛛絲馬跡的cfDNA最為有效的方法。

在這個方法的實驗之下,他們僅需目前一般方法的五萬分之一的DNA量。也就是說,只要能從血液或體液中分離出0.01微微克(10-12 g, 或picogram)的cfDNA,TOP-PCR就可以順利的複製出足夠的相同DNA片段去做定序(圖2,B)。這個突破,打破以往最低量的限制,提供定序界更多的機會,可以進行更為完整且深入的分析。此外,如上所言,即使是單倍數的cfDNA,亦可掌握到70%,遠遠超過目前市售方法所提供的40%良率。再加上單一試管的實驗步驟,使TOP-PCR得以為次世代定序開拓新的一頁。

2017TOP PCR F2
圖2. TOP-PCR與Illumina PCR的比較。一位健康女性的血漿內的cfDNA,經過連續(5 ng-0.01 pg)稀釋之後分別以兩種方法複製。A) 使用Illumina的方法。B) 使用TOP-PCR。橫軸代表cfDNA的大小(bp);縱軸RFU代表相對量。PCR連鎖反應的循環數:5-0.5 ng 使用30循環; 其它使用40循環。接合體雙體(adaptor dimer)顯示於A紅色橢圓圈內;欲複製的cfDNA以綠色橫向括號標示於A、B圖下。


「TOP-PCR主要有兩項突破:首先,在DNA定序上打破了最低量(0.5 ng)的限制;而且,即使在0.5 ng以上,TOP-PCR的靈敏度是一般的兩倍。所以,它為疾病診斷創造莫大的潛力。下一步該做的是與診斷界和定序界合作,將此科技實際應用於臨床上。」邱老師說。

不難想像,TOP-PCR 的出現,將為遺傳病變與傳染疾病的研究拓展無限的空間。以癌症的診療而言,倘若可以朝向以患者血液內極少腫瘤DNA片段的偵測做為預後追蹤、預防療法,不但可以簡化目前的方法,也更能及時給予患者協助;此外,也可以應用在產前胎兒健康的檢測,對於廣大科學研發的助力,更是可以期待。

TOP-PCR的方法已經獲得台灣專利,其它國家的專利申請也經由中研院進行中,該研究的詳細結果發表在2017年1月17日的Scientific Reports 期刊上。(參考:http://www.nature.com/articles/srep40767)

 2017TOP PCR F3
圖3. 研究團隊(由左至右): 陳彥如、陳子翰、邱國平 博士、蕭欣杰 博士、乃育昕 博士、黃鈺峰 博士。

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