轉酮酶解密 發現前所未見的雙自由基中間體

血液中的血糖濃度是受到葡萄糖代謝的調控,而五碳糖磷酸化路徑(pentose phos-phate pathway; PPP)更是葡萄糖代謝中一個至關重要的調節機制。五碳糖路徑是生物體內代謝磷酸糖的主要方式,當「轉酮酶(transketolase)」加上硫胺輔酶ThDP (thiamine diphosphate, ThDP, 維生素B1的活性態)成為全酶後,就可以把體內不同碳鍊長度的糖分子做轉換,例如,兩分子五碳糖轉換成一分子六碳糖和一分子四碳糖;大自然便透過這個微妙的機制,供應人體所需各種形態的醣分子。

為了更明確的瞭解五碳糖磷酸途徑中,轉酮酶和輔酶在每一步驟所扮演的角色,李宗璘老師的團隊經歷了相當長期的探索,以結晶方式捕抓到ThDP輔酶在五碳糖磷酸反應途徑中所呈現的種種立體構型,並運用超高解析度X光解析這些晶體,藉由分析各原子之間的角度和鍵長,不但完美的證明了這些構型的存在,更找出了過去生化界推論的盲點,指出在ThDP結構內雙自由基電子實際上是扮演了催化的關鍵角色。

團隊從酵母菌中純化出TK轉酮酵素,其以硫胺ThDP作為輔酶,催化酮糖與醛糖之間進行兩個碳單元的轉換。研究中發現輔酶ThDP在TK酵素中是以高活性卡賓(carbene)中間體方式存在,如此一來才能當作親核劑(nucleophile),攻擊糖類基質上的羰基(C=O)進行反應。

 

一般文獻中在描繪此一反應機制時,僅僅提及兩種以共振方式存在的碳陰離子(carbanion)和卡賓(carbene)中間體。

秉持科學人求真的原則,團隊沒有用「教課書上說甚麼,就是甚麼」來畫地自限。在投入大量心力,把糖類基質、轉酮酶和輔酶,這三種分子組合在一起,產生結晶體後,利用超高解析X光繞射的方法去解析晶體,反覆驗證,求真求實。結果,除了文獻中所提及兩種廣為人知的中間體外,李老師的團隊更進一步發現其他數種不曾被報導過的中間體,其呈現出不同的鍵結長度及鍵結角度。但這樣還不足以解釋,碳碳鍵的生成與斷裂是怎麼做到的。

李老師因此大膽提出以雙自由基形式存在的中間體。為了提出更多證據支持此推論,李老師團隊以重水(D2O)置換中間產物上的氫原子,同時,又做了多次的質譜、NMR、EPR等光譜分析,在這些配合實驗的數據佐證下,證明了硫胺在TK酵素活性區域內確實以碳陰離子(carbanion)和卡賓(carbene)以及雙自由基(diradical)的形式互相轉換,以一種動態平衡的狀態混合存在著。這些以往僅見於推論中的中間產物,因為極不穩定,所以存在的時間極短,現在竟然可以將其結晶下來,並以高解析X光繞射技術讓這些結構以3D立體模型方式躍然紙上。

換句話說,這其中分子看似不動,其實,分子內因為雙自由基的現象,其實是一直在不斷地變化著,端看是否能在剎那間捕捉到它們的動態。

此外,我們對於維生素B1的認識是,人體內過多的B1會自然溶於水排泄掉,其實,應該說除了正常排泄管道外,在沒有適量的受質存在下,有一部分維生素B1很有可能受到酵素誘導產生雙自由基,自由基會與氧氣接觸進行過氧化作用,進而降解成其他小分子而耗損掉!

李老師表示,根據這些具體的模型,不僅可以探討各個反應分子相對位置所發揮的功效,還可以推測出以往因為能量屏障而未能考慮的反應機制。團隊所建立的糖類基質、轉酮酶和輔酶三者複合體模型和反應機制,如同拿著放大鏡、鉅細靡遺地觀察到糖類基質、轉酮酶和輔酶三者在糖類代謝中行進的腳步。這些研究發想的新觀念,開啟了另一扇門,在進一步研究含有ThDP的相關酵素之後,可以更廣泛的將其運用到生物催化以及藥物設計上。

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