硫酸雙醣分子可修復蛋白質增益毒性 漸凍人治療新思路

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發佈：2024-03-18, 週一 10:00

2014年，名為「冰桶挑戰」（Ice Bucket Challenge）的慈善公益活動在社群網路上掀起浪潮，喚起大眾對運動神經元疾病的關懷，尤其是肌萎縮性脊髓側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，簡稱ALS）。而額顳葉失智症(Frontotemporal Dementia，簡稱FTD)是全球人數僅次於阿茲海默症(Alzheimer’s disease)的另一型失智症。這兩種疾病都是好發於中年人口的神經退化性疾病。

ALS病患因脊髓、腦幹或大腦運動皮質區運動神經元的退化，引起全身肌肉漸進性的萎縮與僵直，在台灣又稱作「漸凍人症」，知名的科學家史蒂芬‧霍金（Stephen William Hawking）與前美國棒球明星盧‧賈里格（Henry Louis Gehrig），皆是ALS的患者。FTD患者則因額顳葉神經元退化，特別在語言和社交行為上漸漸地展露出病徵，如：行為異常、語言障礙等，好萊塢動作巨星布魯斯威利(Bruce Willis)即在2022年因此疾病宣布息影。

儘管這兩種疾病在臨床表現上有所不同，卻共享相當多的病理特徵和基因變異。臨床數據顯示95%ALS和70%FTD患者屬於偶發型，不易分析與致病機轉有著密切的關連性基因變異來源。然而，在家族性遺傳患者上，這兩種疾病最常見的基因突變皆來自位於C9ORF72基因非編碼區域中DNA重複擴增GGGGCC (G4C2) 序列的突變。

本中心陳韻如老師實驗室長期深耕與蛋白質錯誤折疊相關的神經退化性疾病研究，最近，該研究團隊在Science Advances期刊發表論文，闡述利用化學合成雙胜肽，首次建立並證實聚甘氨酸-精氨酸(poly-GR)和聚脯氨酸-精氨酸(poly-PR)雙胜肽重複序列蛋白一種新的毒理模型；並以硫酸雙醣分子成功抑制其對於腦神經細胞的毒性，減少神經元的退化。

相較於正常人的C9ORF72基因，G4C2重複次數僅從2到24次不等，ALS/FTD患者的G4C2可能出現擴增數百次至甚至上千次。當G4C2具有高度重複擴增的情形時，容易觸發「非傳統ATG啟動子」（non-ATG-initiated translation）的蛋白轉譯機制（RAN）作用，開始產生poly-GA、poly-GR、poly-GP、poly-PR和poly-PA等五種雙胜肽重複序列，經過錯誤摺疊後在細胞中形成包含體(inclusion bodies)。臨床上，患者的多個神經部位，如海馬迴、額葉、運動皮質層、脊髓和小腦等，皆實際發現到這些位於包含體裡的蛋白質，其中又以poly-GA含量最豐富。而poly-GA在堆積的過程後產生類澱粉沉積物才具有毒性，但poly-GR和poly-PR的高度親水性，使其產生不同於類澱粉沉積物的毒性機制，而且還更毒。

本篇論文第一作者博士生張育仁首先與中心胜肽合成設施利用人工化學合成方法，模擬不同長度的G4C2重複序列，製作出不同長度的poly-GR/-PR蛋白質。在細胞實驗顯示，當重複超過25-30次的poly-GR蛋白質作用於神經元細胞時，不但會降低神經細胞的存活率，也會破壞細胞膜和核膜，並藉由與核苷酸的結合干擾細胞的重要核苷酸機制，例如DNA複製、轉錄和蛋白質轉譯等，使其皆無法正常運作。這些致病機制團隊也利用細胞內表現poly-GR/-PR蛋白質獲得驗證。

研究團隊緊接著與國家同步幅射中心(NSRRC)鄭有舜研究員團隊合作，利用先進TPS13A 生物結構小角X光散射(SAXS)光束線對poly-GR和poly-PR在水溶液中的結構進行解析。配合分子模擬與SAXS數據的解析，提出poly-GR和poly-PR軟結構特徵模型，能系統性詮釋軟螺旋結構特徵生成與poly-GR與poly-PR組成胜肽與鏈長間的關聯性。於水溶液中的結構分析結果指出只有poly-GR在特定長度後才能形成軟螺旋的結構特徵，而這也是poly-GR表現其生物毒性的開始。這個新穎發展的SAXS散射技術結合分子模擬的方法，是在解析非穩定蛋白質分子水溶液結構的一大突破。

圖一：長鏈poly-GR所形成的螺旋結構以及對於生物脂質雙層膜的破壞 (A)胜肽序列重複增加到20次以上時，poly-GR蛋白質明顯形成螺旋結構。Poly-GR和poly-PR蛋白質造成(B)人工合成脂質體和(C)細胞膜的破損。

由於神經細胞是無法再生的，提高細胞存活率是一種治療方向。研究團隊利用中心洪上程特聘研究員實驗室建置的硫酸乙醯肝素分子庫，篩選出一個硫酸雙醣分子（Sucrose Octasulfate, SOS），並在神經母瘤細胞和與中研院細生所郭紘志研究員和北榮周邊神經科李宜中主任合作的由ALS病人多功能幹細胞分化的運動神經細胞中，證實成功減緩前述由poly-GR/-PR所引發的神經毒性。

圖二 : 由硫酸乙醯肝素分子庫所篩選出的雙醣分子化學式 (A)硫酸乙醯肝素分子庫的示意圖及可進行修飾的位置及種類。(B)篩選出可降低poly-GR/-PR蛋白質細胞毒性的硫酸乙醯肝素分子和硫酸雙醣分子後進行半數有效濃度的測定(EC50)以及最有效分子(SOS)的化學式。

近一步，團隊與中研院生化所姚季光老師合作，先以基因轉殖果蠅做動物試驗，經過誘導，使果蠅的神經系統出現具毒性的poly-GR/-PR蛋白質，縮短其壽命及降低運動能力；接著，在果蠅的食物中投入雙醣分子。結果顯示，在食物中添加雙醣分子的果蠅比未添加的果蠅延長25％的壽命。藉由觀察果蠅往上爬行的習性，到了第13天，90%有食用雙醣分子的果蠅仍在健康基準線以上活動，未食用雙醣分子的果蠅僅剩下一半。後續團隊在野生型小鼠的運動皮層施打poly-GR蛋白質和藥物，亦得到正面的結果。

圖三、果蠅的生命周期和運動能力數據以及小鼠運動測試和運動皮層染色 (A-D) 在果蠅神經系統表達poly-GR和poly-PR蛋白質造成壽命縮短及運動能力降低可經由在食物中添加硫酸雙醣分子而獲得改善。 (E-I) 注射poly-GR於小鼠腦部運動皮層區會損害小鼠平衡能力和減少神經元數量，但伴同注射硫酸雙醣分子則可避免poly-GR對於小鼠行為和神經元的損傷。

漸凍人症的致病原因，迄今仍未十分明瞭，已知有5%的病例可能與遺傳及基因缺陷有關，好發在40～65歲中年人。本研究關注在有家族性遺傳患者上最常發生突變的C9ORF72基因，探討poly-GR/-PR蛋白質的毒性機制是否和病理上DNA的重複次數有所關聯，提供存在在ALS病患中G4C2重複次數的最小閥值機制，並提出螺旋結構引發對生物脂質雙層膜的破壞，和首次發現其干擾細胞重要核苷酸機制；亦藉由多功能幹細胞分化而來的運動神經元細胞、果蠅、和小鼠實驗提出硫酸雙醣分子在ALS治療策略的方向。研究團隊希望發掘更多致病機制的細節，提供科學界更多神經退化性相關疾病的治療線索。

圖四 : Poly-GR和poly-PR致病機制和硫酸雙醣分子藥物作用 Poly-GR和poly-PR皆會(A)破壞細胞膜，然而長鏈的poly-GR具有螺旋狀的構型，更增強了這個效應。進入細胞後，他們會(B)抑制核-質之間的運輸機制。而poly-GR和poly-PR最終會進入細胞核內，尤其在核仁可以看到大量的poly-GR和poly-PR，進而(C) 抑制了DNA轉錄的過程。在加入硫酸雙醣分子後，這些細胞毒性會因為硫酸雙醣分子和poly-GR/-PR的結合進而降低，增加細胞的存活率。

本研究成果由基因體研究中心陳韻如研究員指導，主要實驗由第一作者中研院跨領域神經科學國際研究生學程博士生張育仁完成，並由團隊助理楊季樺執行小鼠實驗，博士後研究員賴維斌博士製備初代神經細胞，莊靜玉博士分化多功能幹細胞。並與國家同步幅射中心鄭有舜研究員，本中心洪上程特聘研究員，生化所姚季光副研究員，細生所郭紘志研究員，北榮李宜中主任等協力共同完成。本篇研究論文「Sulfated Disaccharide Protects Membrane and DNA Damages from Arginine-rich Dipeptide Repeats in ALS」可在線上閱讀：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj0347